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原位雜交實驗操作步驟
點擊次數:2137 發布時間:2017-04-26

一質粒制備

1質粒的轉化和擴增

1.1制備XL1-Blue感受態細菌

1.取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mllb培養基的錐形瓶中,37℃、100rpm培養4h,離心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重懸細菌,冰浴30min,離心,棄上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌,分裝(200μ/tube),-80℃保存。

2.轉化:在冰浴中將1管XL1-Blue感受態菌解凍,將濃度為2ng/μ1的質粒dna4μ1加入到8Oμ1感受態菌中。

3.輕輕搖勻,冰浴30min。

4.42℃熱激9O秒,然后迅速冰浴2min。

5.加入LB培養液(無氨芐青霉素)0.8ml,在37℃,100轉/min水浴孵育60min。

6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨芐青霉素50mg/ml,1μl/ml培養基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培養12-16h。

1.2鑒定和挑選含重組質粒的菌落

1.用無菌牙簽挑取單菌落,接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養液的離心管中,于37℃,200轉/分培養2h,取1ml之一eppendorf離心管,加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振蕩30秒。

3.在70℃溫育5min,然后冷卻到室溫。

4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液,振蕩3O秒后,冰浴5min。

5.12000g,4℃離以3min,以除去細菌碎片。

6.制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到樣品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V,進行電泳。

7.當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2/3-3/4時,停止電泳,在紫外燈下檢查質粒DNA分于量的大小是否與轉入質粒相符。

1.3質粒的擴增和純化

1.用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg/ml)培養液的聚丙烯管中,于37℃,200轉/分培養3h。

2.將菌液轉入含70mlLB-氨芐青霉素培養液的250ml錐形瓶中,37℃,200轉/分培養過夜(12-16h),細菌渾濁。

3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,終濃度為170μ/ml)。37℃,200轉/分培養12-16h。

4.將培養的細菌倒入50ml的離心管中,6000rpm,4℃離,th,15min,沉淀細菌。

5.棄凈上清夜,用2ml預冷的溶液I,懸浮菌體沉淀,劇烈振蕩,于室溫靜置5min

6.加入新配制的溶液II4ml,快速用手晃動10秒,顛倒數次后,于室溫靜置10min。

7.加入預冷的溶液III3ml,溫和振蕩l0秒,于冰上靜置10min,出現白色絮狀沉淀。

8.6000rpm,4℃離心15min,保留上清。

9.將上清(若帶細菌殘片,則再次離心)移入另一50ml的離心管中,加入0.6倍體積的異丙醇混勻,于室溫靜置10min。(或-20℃4h,或4℃過夜,可便核酸沉淀)

10.12000rpm,4℃離心15min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘兼上清液流盡。

11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000rpm離心,15min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。

12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀,轉移至1.5mlEppendorf管中。

13.加入用冰預冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混勻。12000rpm,4℃離心15min,以沉淀高分子量的RNA。

14.將上清轉移到另一1.5mlEppendorf管中,加等量異丙醇,充分混勻,于室溫靜置10min。

15.12000rpm,4℃離心15min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘余上清液流盡。

16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000rpm離心,15min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。

17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉移到另-1.5mlEppendorf管中,室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。

18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L),混勻,4℃12000rpm離心5min以回收質粒DNA,棄去上清。

19.加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀,再分別用等體積的Tris飽和酚、酚:lvfang:異戊醇(25:24:1)、和lvfang各抽提一次。

20.將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中,加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無水乙醇,充分混勻后于4℃放置30min。

21.于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質粒DNA。盡可能棄去上清,敞開管口,置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發殆盡。

22.加入400μl處于4℃的70%乙醇,稍加振蕩,漂洗沉淀,4℃12000rpm離心2min。

23.吸去上清,室溫敞開管口,直到乙醇完全揮發。

24.用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1:100稀釋后,測定其OD260、OD280,以確定質粒DNA的純度和濃度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280對DNA而言其值大約為

1.8,高于2.0則可能有RNA污染,低于1.8則有蛋白質污染。;DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(μg/μl)。

26.質粒DNA溶液于-20℃保存待用。

二、cRNA探針的標記

1.將質粒DNA,用相應的限制性內切酶線性化,通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。

2.線性化后的DNA按“質粒的純化”步驟19-24進行純化,作為cRNA探針標記的模板,用相應的RNA聚合酶合成地高辛標記的反義和正義RNA探針。

3.進行體外轉錄,步驟如下:

4.在冰上將各試劑加入一1.5ml無RNA酶的Eppendorf管中。

三、原位雜交

3.1冰凍切片與雜交前預處理

1. 將子宮樣品從-80 ℃取出,用OCT包埋,在-23 ℃(切片機腔體溫度)平衡

至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上,切10μm厚的連續組織

切片,平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片預先經180 ℃干

烤6小時),保存于-70 ℃冰柜備用。

2. 冰凍切片經室溫干燥10 min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO

min。

3. 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次,每次5 min。

4. 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后,重復步驟4)。

5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1),37 ℃孵育15 min,重復步驟4)。

6. 經0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA

(乙酸酐/三乙醇胺,pH 8.0)中乙酰化10 min。

(在大多數實驗中,步驟4,5,6省略)

7. 5 x SSC中平衡15 min。

3.2雜交

8. 在脫水后的玻片上滴加預雜交液(約100 μl/玻片),置于放有濕盒液(50%

甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl,pH 8.O)的濕盒中,

55~58 ℃下的烘箱中預雜交2 h。

9. 甩掉預雜交液,地高辛標記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng/μl)經

70 ℃變性1O分鐘,置冰上1 min,玻片上滴加預雜交液(約60μl/玻片),

覆蓋parafilm膜,放濕盒中在48~58 ℃下雜交18-30 h。

3.3雜交后處理

1O.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉雜交液,用52 ℃預熱的5×SSC洗

30 min。

11.在無DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。

12.分別依次用52 ℃預熱的2 X SSC,1 X SSC和O.1 X SSC洗2次,每次30 min。

3.4雜交信號檢測

13.在緩沖液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5,0.15M NaC1)中平衡5min。

14.在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:500~1:2000稀釋于含0.5%

阻斷液的緩沖液A中),室溫反應2h。

15.用緩沖液A洗2次,每次15 min。

16.在緩沖液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2,pH 9.5)中平衡5

min。

17.硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B

中,每ml緩沖液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染

液在濕盒中顯色過夜。

18.充分顯色后,用EDTA(1 mM EDTA,pH 8.0)洗15 min終止反應。

19.在95%乙醇中洗l h以除去非特異的背景。

20.用蒸餾水洗15 min除去可能存在的結晶體。

21.脫水、透明,用中性樹膠封片。

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