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吖啶橙染色原理
點擊次數:6106 發布時間:2017-07-06
吖啶橙熒光染色法基本原理:
    吖啶橙(acridine orange,AO)是一種常用熒光染料,吖啶橙與原代細胞內的DNA、RNA都有親和力,但有一定的特異性,即結合后發不同顏色的熒光,DNA呈亮綠色,而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡便快捷,既可染活原代細胞又可染固定原代細胞。用于直接染色觀察活原代細胞或固定染色觀察原代細胞均可。吖啶橙對活原代細胞毒性小,配成1×10-4-2×10-4可用于直接染色活原代細胞和進行熒光顯微鏡觀察,但不持久,用固定染色觀察法效果更好。
 
材料:
1.蓋片單層培養原代細胞;
2.固定劑:95%乙醇或乙酸/甲醇(現配);
3.吖啶橙:用生理鹽水配成1%的干液。使用時再用PBS稀釋成1×10-4-2×10-4mol/L pH4.5-5.0的染色液;
4.0.1mol/L的CaCl2;
5.1%乙酸。
 
染色步驟:
1.將蓋片單層培養原代細胞從瓶中取出,立即用溫Hanks液漂洗3-5s,以去除培養基中血清;
2.投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15-30min,用濾紙接觸蓋片邊緣,蓋片微干;
3.用1%乙酸酸化30s;
4.用1×10-4-2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min;
5.用0.1mol/L的CaCl2處理30s-2min;
6.PBS漂洗3次,每次數秒;
7.PBS封片,熒光顯微鏡下直接觀察并拍照;
8.注意事項:觀察中應隨時填加PBS以避免標本干涸。如用油浸鏡觀察,需再覆以大蓋片蓋在附有原代細胞蓋片上,保證原代細胞面朝上,用無熒光性油浸鏡觀察。原代細胞蓋片標本在95%乙醇中能保存數日后仍可觀察,如退色,再用AO染色。鏡下觀察,DNA呈翠綠色,RNA呈火紅色。 結果:原代細胞核因含DNA呈綠色,細胞質及核仁因含RNA呈紅色。
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