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蛋白質含量測定法
點擊次數:784 發布時間:2017-09-25

蛋白質含量測定法,是生物化學研究中常用、基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經典方法,即定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法,即考馬斯亮藍法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法靈敏度高,比紫外吸收法靈敏10~20倍,定氮法雖然比較復雜,但較準確,往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。
值得注意的是,這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質,因為一種蛋白質溶液用這四種方法測定,有可能得出四種不同的結果。每種測定法都不是無缺的,都有其優缺點。在選擇方法時應考慮:①實驗對測定所要求的靈敏度和度;②蛋白質的性質;③溶液中存在的干擾物質;④測定所要花費的時間。
    folin—酚試劑法早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾lowry反應,而且對后者的影響還要大得多。考馬斯亮藍法(Bradford法),由于其突出的優點,正得到越來越廣泛的應用. 索萊寶公司提供的Bradford 蛋白濃度測定試劑盒可以用于蛋白質含量測定,簡單快速。

Bradford 蛋白濃度測定試劑盒 
貨號:PC0010 
規格:2500T 
保存:開封使用后請密封保存,本試劑盒自訂購之日起九個月內有效。 
產品內容: 
    組成  包裝(2500微孔)  保存   
    5×G250 染色液  100ml  2-8℃   
    PBS稀釋液  30ml  2-8℃   
    蛋白標準(5mg/ml BSA)  1ml  -20℃ 
產品簡介: 
  考馬斯亮蘭G-250 染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的大吸收峰的位置(Imax),由 465nm變為 595nm,在一定的濃度范圍內,測定的吸光度值 A595 與蛋白質濃度成正比。Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響,樣品中巰基乙醇的濃度可高達 1M,二硫蘇糖醇的濃度可高達 5mM,但受略高濃度的去垢劑影響,需確保 SDS 的濃度低于 0.1%,Triton X-100 低于 0.1%,Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產的 BCA蛋白濃度測定試劑盒。 
操作說明:操作說明: 
  一.微孔酶標儀法 
 1.  完全溶解蛋白標準品,取 10ul,稀釋至 250ul ,使終濃度為 0.2mg/ml。待測蛋白樣品在什么溶液中,標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見,也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀釋標準品。 
 2. 5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻,取 1ml 5×G250 染色液,加入 4ml 雙蒸水,混勻成 1×G250染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
 3.  將標準品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中,加 PBS 稀釋液補足到 20 微升。 
 4.  將樣品作適當稀釋(好多做幾個梯度,如作2 倍、4 倍、8 倍稀釋),加 20 微升到96 孔板的樣品孔
中。由于移液器在取小量時的誤差,標準線前面的點可能不很準確,所以盡可能的讓樣品點落在標準線1/2 后。  
 5.  各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250染色液,室溫放置 3-5 分鐘。 
 6.  用酶標儀測定 A595,或560-610nm之間的其它波長的吸光度。 
 7.  根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。 
 二.分光光度計法 
  如無酶標儀,染色反應可在離心管中進行,反應液混勻后加入比色皿中,使用分光光度計測定吸光值。 
步驟如下: 
   1.  取八支(或者更多)干凈的 10ml 離心管,標記上號。 
   2.  取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml。 
  3.  5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻,取 10ml 5×G250 染色液,加入 40ml 雙蒸水,混勻成 1×G250 染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
4.  按下表加入試劑(以每孔 5ml 計,多余的用來清洗比色皿) 
離心管號  1  2  3  4  5  6  7(樣品管 1) 8(樣品管 2)   9(樣品管 3)
標準蛋白 BSA  0ul  100ul  200ul  300ul 400ul 500ul 500ul 適當稀
釋的樣品 1 
500ul 適當稀
釋的樣品 2 
…… 
PBS  500ul  400ul  300ul  200ul 100ul 0ul  0ul  0ul   0ul 
1XG250 染色液  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml 
5.  反應 3 分鐘后測 OD 值。為了實驗的準確性,可每間隔 2 分鐘加一管染色液,每間隔 2 分鐘測一管 OD
值。如下表: 
離心管號  1  2  3  4  5  6  7  8  …… 
加染色液(分鐘)  0  2  4  6  8  10  12  14  …… 
測 OD值  3  5  7  9  11  13  15  17  …… 
考馬斯亮藍法(Bradford法),由于其突出的優點,正得到越來越廣泛的應用。

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