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蛋白電泳 SDS-PAGE及WESTERN BLOT
點擊次數:1139 發布時間:2017-10-10

蛋白電泳 SDS-PAGE原理

SDS是一種陰離子表面活性劑,能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵,并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物,使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此,各種蛋白質-SDS 復合物在電泳時的遷移率,不再受原有電荷和分子形狀的影響,而只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)。實驗使用過程中,還加入DTT或者巰基乙醇,以打開蛋白間的二硫鍵,破壞蛋白質的四級結構。SDS—PAGE常采用垂直板不連續系統(分離膠與濃縮膠)。

一、樣品制備

本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液,每款裂解液會配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。

  • 實驗試劑
  • 蛋白提取
  • 蛋白定量
產品貨號產品名稱
R0010RIPA_
R0020普通RIPA
R0030非變性組織細胞裂解液
A8260Aprotinin 蛋白酶抑制劑(抑肽酶)
P8100Pepstatin A 胃蛋白酶抑制劑
P1260(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
T8031Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制劑
P1260(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
539133Protease Inhibitor Cocktail Set VI
539134Protease Inhibitor Cocktail Set III
PC0030Lowry法蛋白濃度測定試劑盒
PC0010Bradford蛋白濃度測定試劑盒>
PC0020BCA蛋白濃度測定試劑盒

二、蛋白電泳

 

  • 實驗試劑
  • 預制膠
  • 制膠
  • 上樣及電泳
  • 染色

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案,實驗室可根據自己的情況和習慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。

系號產品貨號產品名稱系號產品貨號產品名稱
1T8060TRIS 三羥甲基氨基甲烷11S10514XSDS-PAGE分離膠緩沖液(PH=8.8)
2G8200Glycine 甘氨酸12S10524XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液(PH=6.8)
3S8010SDS 十二烷基硫酸鈉13P10164×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)
4A8080Acrylamide 丙烯酰胺14P10154×蛋白上樣緩沖液(含DTT)
5M8200N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺15D10701M DTT
6A8090Ammonium Persulfate 過硫酸胺16A103010%過硫酸氨
7D8220DTT 二硫蘇糖醇17T10201M Tris-HCL (PH6.8)
8M8210β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇18T10101.5M Tris-HCL(PH8.8)
9T8090TEMED 四甲基乙二胺19S101010%SDS
10A101030%丙烯酰胺(29:1)20T10705×Tris-甘氨酸電泳緩沖液

三、WESTERN BLOT

經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分,此技術稱為免疫印跡(Western blot)。Western blotting檢測系統除需要過氧化物酶標記的各種二抗外,還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學發光兩種試劑及相應試劑盒。

  • 轉膜
  • 顯色

Millipore和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜,具有0.22um和0.45um兩種規格。 轉膜后還可以用P0012(10×麗春紅)檢測轉膜效果,尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節省成本和時間,您可以選擇本公司的SW3020(Western Blot膜再生液)對用過的膜進行清洗,隨后,可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗。 膜再生液實質是在不影響膜上結合的抗原的條件下將抗體洗脫下來,實際操作中,膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意:適用于 ECL和類似的化學發光試劑進行的 Western 檢測。不適用于非化學發光試劑進行的 Western檢測,例如DAB,NBT/BCIP。

產品貨號產品名稱
P001210×麗春紅
SW3010膜封閉液
A1800抗體稀釋液
A1810一抗稀釋液
A1820HRP標記抗體稀釋液
A1830AP標記抗體稀釋液
A1840熒光抗體稀釋液
T10851×TBST

實驗操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。

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