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單寧含量試劑盒說明 微量法 技術文章
點擊次數:348 發布時間:2019-06-04

貨號:MS1516                                                 規格:100 管/96 樣

單寧含量試劑盒說明書 微量法

正式測定前取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

單寧是一類廣泛存在于植物體內的多元酚化合物,又稱植物多酚。具有獨特的化學性質和 多種生理活性,如能與蛋白質、生物堿、多糖結合;能與多種金屬離子發生絡合或靜電作用; 具有止血、抑制微生物、抗過敏、抗突變、抗腫瘤、抗衰老等生理活性。

測定原理:

單寧在堿性環境下與磷鉬酸反應,生成藍色化合物,在 760nm 處有大吸收峰。

自備實驗用品及儀器:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸 餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:液體 4mL× 1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3mL × 1 瓶,4℃保存;

單寧的提取:

按照組織質量(g):蒸餾水體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 蒸餾水),充分勻漿后轉移到 EP 管中,80℃水浴提取 30min, 8000 g,25℃離心 10 min,取 上清液待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 760nm 處,蒸餾水調零;試劑一和試劑二 37℃預熱 10min 以上; 

2、操作表:

試劑名稱(µL)      對照管      測定管

樣本                        5

蒸餾水            135        130

試劑一           35         35

       混勻,室溫靜置 5min

試劑二           30          30

       混勻,室溫靜置 30min,760nm 處讀取吸光值 A,Δ A=A測定 - A對照,對照管只要做一管。

單寧含量計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1、標準條件下測定的回歸方程為 y = 1.6418x + 0.0134;x 為標準品濃度(mg/mL),y 為 ΔA (A測定 - A對照)。

2、按樣本鮮重計算:

單寧含量(mg /g 鮮重)= [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷(W × V1 ÷ V2)= 0.609 × (Δ A - 0.0134) ÷ W。

3、按樣本蛋白濃度計算:

單寧含量(mg/mg prot) = [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷ (V1 × Cpr) = 0.609 × (ΔA - 0.0134) ÷ Cpr。

V1:加入樣本體積,0.005mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W: 樣本鮮重,g。 

b.用 96 孔板測定的計算公式如下:

1、標準條件下測定的回歸方程為 y = 0.8209x + 0.0134;x 為標準品濃度(mg/mL),y 為 ΔA(A測定  - A對照)。

2、按樣本鮮重計算: 單寧含量(mg/g 鮮重) = [(ΔA - 0.0134) ÷ 0.8209 × V1] ÷ (W × V1 ÷ V2) = 1.218 × (ΔA - 0.0134) ÷ W。

3、按樣本蛋白濃度計算: 單 寧 含 量 (mg/mg prot)= [(Δ A-0.0134)÷0.8209 × V1]÷(V1 × Cpr)=1.218 × (ΔA-0.0134)÷Cpr。

V1:加入樣本體積,0.005mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W: 樣本鮮重,g。 

注意事項:

1、 ΔA 控制在 0.02 ~ 0.5 范圍內,若ΔA 大于 0.5,將樣本提取上清液用蒸餾水稀釋 10 倍后檢 測,計算公式中乘以相應稀釋倍數。

2、 標準曲線線性范圍為:0.025mg/mL ~ 0.5mg/mL。

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