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蛋白質提取的方法總匯
點擊次數:843 發布時間:2016-03-16

1、植物組織蛋白質提取方法
1、根據樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據材料不同適當加入),準備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時)。
3、用離心機離心8000rpm40min411100rpm20min4
4、提取上清夜,樣品制備完成。
蛋白質提取液:300ml
1
1Mtris-HClPH8 45ml
2
、甘油(Glycerol75ml
3
、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone6g
這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!

2、植物組織蛋白質提取方法 
三氯醋酸丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20的條件下保存12小時,然后離心(48000rpm以上1小時)棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%β-巰基乙醇),搖勻后離心(48000rpm以上1小時),然后真空干燥沉淀,備用。
4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(158000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準),可臨時保存在4待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80備用。
藥品:
提取液:含10%TCA0.07%β-巰基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1MDTT65ul/ml
這種方法針對雙向電泳,雜質少,離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少!

3、組織:腸黏膜 
目的:WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達
應用TRIPURE提取蛋白質步驟:
含蛋白質上清液中加入異丙醇:(1.5ml1mlTRIPURE用量)
倒轉混勻,置室溫10min
離心:12000 g10min4度,棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml1mlTRIPURE用量)
振蕩,置室溫20min
離心: 7500g5 min4度,棄上清
重復0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2
沉淀中加入100%乙醇 2ml
充分振蕩混勻,置室溫20 min
離心: 7500g5min4度,棄上清吹干沉淀
1SDS溶解沉淀
離心:10000g10min4
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT
存在的問題:加入1SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結晶?測濃度,含量才1mg/ml左右。
解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮510分鐘,效果很好的。

4、植物材料:水稻苗,葉鞘,根
1200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,離心,10000rpm4度,5min取上清
3、重復離心5min
lysis buffer
urea   np-40  ampholine 2-me  pvp-40

5、蛋白質樣品制備
秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% Trichloroacetic acid(丙酮配制,含10mM0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20沉淀1小時,415000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復溶于1.5ml冷丙酮(10 mMβ-巰基乙醇),再于-20沉淀1小時,同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可調) UKS[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS0.5%DTT(二硫蘇糖醇)2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech IncpH3.5-10)6% Triton X-100]37溫育30min,期間攪動幾次,28 (溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳。或者-70度保存

6、植物根中蛋白質的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 1.5 ml centrifuge tube
(3)
1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4
, 10-15minite
(5)
取上層液,蛋白質就在里面 

 

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