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WHATMAN 3MM濾紙的使用簡介

點擊次數:4967 發布時間:2014/5/4
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【實驗目的】

掌握RNA印跡技術的基本原理,學習RNA印跡技術的操作方法,了解RNA印跡技術的意義與應用。

【實驗原理】

將RNA變性及電泳分離后,轉移到固相支持物上,用于與DNA探針雜交以鑒定其中特定RNA分子的大小與含量。基本原理與Southern印跡相同,但RNA變性方法與DNA不同,不能用堿變性,因為堿會導致RNA的水解。

Northern印跡主要用于組織細胞靶基因表達水平的研究以及對同一組織細胞的不同基因間的表達水平進行比較,或者對不同組織細胞間相同基因的表達水平進行比較。

【實驗對象】

待測RNA樣品。

【試劑與器材】

1. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)。

2. 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳所需試劑。

3. 0.5 mol / L乙酸銨(NH4Ac)。

4. 溴化乙啶 (EB):0.5μg/ml,溶于0.5mol/L乙酸銨中。

5. 0.05mol / L NaOH/1.5mol/L NaCI(選用)。

6. 0.5mol / L Tris·CI (pH 7.4) /1.5mol/L NaCl(選用)。

7. 20×SSC、6×SSC和2×SSC。

8. 亞甲藍(終濃度為0.03%),溶于0.3mol / L (pH 5.2)的乙酸鈉緩沖液中 (選用)。

9. *纖維素 (NC) 膜或尼龍膜。

【實驗方法與步驟】

1. RNA甲醛變性凝膠電泳(5V/cm, 3h),(見附錄三)。

電泳結束后用EB染色:取出凝膠,切下需要染色的泳道,放置于無RNA酶的玻璃平皿,加入0.5mol /L乙酸銨浸泡20min。換液再浸泡20min以除去甲醛,將凝膠轉入含0.5(g / ml EB的0.5mol /L乙酸銨溶液中染色40min,必要時,以0.5mol / L乙酸銨脫色1h。

3.在紫外透射儀中使凝膠中的RNA顯跡,沿凝膠的邊緣放一把尺子拍照,以便隨后能確定膜中的條帶。

4.將非染色的部分凝膠放置于無RNA酶的玻璃平皿中,加足夠的DEPC處理的去離子水浸洗幾次以除去甲醛。

5. 凝膠浸泡在10倍體積的0.05mol/L NaOH / 1.5mol/LNaCl中30min,使RNA部分水解。接著浸泡于10倍體積的0.5mol/L Tris·C1(pH 7.4) / 1.5mol/LNaCl緩沖液中和30min (可選), 將膠的多余部分切除,并切邊標記。

6. 將溶液換成10倍體積的20×SSC,浸泡45min。

7. 在一玻璃或塑料平皿中放置-塊比凝膠略大的有機玻璃作為平臺(必要時,可并排放兩塊或更多) ,加入足夠的20×SSC以使平臺半淹沒在液體中。

8. 構筑轉移平臺,剪3張與平臺同樣大小的Whatman 3MM濾紙,放在平臺表面,以20×SSC潤濕。把凝膠置于濾紙表面,用玻棒滾動表面以壓擠去除氣泡。切4條塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的邊緣。

9.剪一片與凝膠暴露面積大小相當的尼龍膜或NC膜,在一個無RNA酶的玻璃平皿中加入約0.5mm深的用DEPC處理的去離子水,將膜漂在水面使之潤濕,直至膜沉沒在水中。如果是尼龍膜,只需讓膜在水中泡上5min,如果是NC膜,則換成20×SSC再浸泡10min。

10.將潤濕的膜放在凝膠表面,用干凈刀片切去濾膜一角,使其與凝膠的切角相對應,排去氣泡,以20×SSC漂洗膜表面。切 3張與膜大小相當的濕潤的Whatman3MM濾紙,放于膜的表面。趕出氣泡。然后將與膜大小相當的紙巾整齊地堆放在濾紙的表面,高約4cm。

11. 在紙堆的頂部放一塊玻璃平板,壓一重物 (0.2~0.4kg),放置過液。

12.拆卸轉移裝置,回收膜和壓扁了的凝膠。在膜上用鉛筆標上加樣孔的位置和方向。

 

13.用2×SSC洗膜,然后放于濾紙上,讓膜于室溫干燥30分鐘。NC膜則應夾于2張Whatman 3MM濾紙之間,80℃真空干烤2h。將干的轉印膜置于可透過紫外線的塑料保鮮膜中,帶有RNA的一面朝下,置于紫外透射儀(波長在254nm)上,以合適的照射強度進行紫外線交聯,以固定RNA。備作核酸雜交。

14. 凝膠可按步驟2,用EB染色以檢查轉印效率。

【注意事項】

1.為了抑制RNA酶的活性,所有用于Northern印跡的溶液,均須用經DEPC處理過的無菌去離子水配制。DEPC是一種致癌劑,須小心操作。尤其在用DEPC處理乙酸銨時,因為DEPC能與銨離子反應產生氨基甲酸乙酯(一種潛在的致癌劑),故在以DEPC處理乙酸銨時,更須分外小心。

2.RNA極易被環境中存在的RNA酶降解,因此須特別警惕RNA酶的污染

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