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感受態細胞制備原理與試驗方法
點擊次數:743 發布時間:2016-01-29
 

感受態細胞制備原理與試驗方法

一、實驗原理

    轉化率的高低與受體菌的感受態有關,只有處于感受態的細胞才能攝取外源DNA分子。用預冷的CaCl2溶液處理對數期的細胞培養物,可誘導細菌產生短暫的感受態,在此期間,它們易于接受外來DNA。轉化混合物中的DNA形成抗Dnase的羥基—鈣磷酸復合物黏附于細胞表面,經42℃短暫熱擊后,促進細胞吸收DNA復合物,在豐富培養基上生長數小時后,球狀細胞復原并分裂繁殖,被轉化的細菌中,如果外源DNA中的基因在轉化的細菌中得到表達,在選擇性培養基上,可選出所需轉化子。


二、實驗方法
  (一)感受態細胞制備:
    1)從保藏的甘油管(-40℃)挑取大腸桿菌DH5α劃線于LB平板上,在37℃恒溫培養過(16-18h)。
    2)挑取單菌落于50mL LB培養基中37℃、200 r/min培養3-4h,至出現薄霧狀菌懸液即可。
    3)將培養液置于冰上預冷15min,并間斷輕輕搖動。
    4)將冷卻的培養液倒入己在冰上預冷的50mL離心管中。
    5)在冷凍離心機中離心,4℃ 3000r/min 5min。
    6)棄上清、加入15mL冰上預冷的0.1mol/L CaCL2溶液,輕輕旋轉,使細胞充分重新懸浮,冰上放置20-30min。
    7)于4℃3000r/min離心5min。
    8)棄上清,加入2mL冰上預冷的0.1mol/LCaCl2溶液,輕輕旋轉,使細胞充分重新懸浮,5min后就可以用于轉化實驗,或添加保護劑,低溫或超低溫冷凍貯藏備用。

  (二)質粒轉化:
    1)取出制備好的感受態細胞,迅速融化放在冰上。
    2)將感受態細胞分裝成200μL/1.5mL離心管,每人3管,分別做陽性對照(加入5μL pKS質粒DNA),陰性對照(加超純水5μL)和酶連產物轉化(酶連產物5~20μL),用微量移液器輕輕吸打均勻、在冰上放置30min。
    3)熱擊  將離心管放置42℃水浴60-90s(勿動離心管)。
    4)冰浴  快速將離心管轉移到冰上,放置l-2min(時間不能太長)。
    5)復蘇  每管加800μL,SOC培養基,在37℃ 200r/min振蕩培養50-60min,使細菌復蘇,抗性得以表達。
    6)涂皿  將三種不同處理各取100μL 左右轉化液徐布在含有4μL IPTG,40μL x-ga1和氨芐青霉素(Amp 50μg/mL)的平板上。
    7)倒置平板于37℃培養16-18h,觀察實驗結果并記錄結果。

 
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