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免疫組化sabc法的原理和優點
點擊次數:2265 發布時間:2016-03-07
 

免疫組化sabc原理是親和素(Avidin)存在于雞蛋中,分子量67000。是一種堿性蛋白質,具有對生物素近乎于共價鍵的結合力。鏈霉親和素是一種從鏈霉菌(Streptomyces Avidinii)培養物中所提取的蛋白質,分子量47000,不含糖鏈,等電點IP=6.0-6.5。和親和素一樣,也有四個生物素結合位點,親和力高達10-15M。和親和素相比,鏈霉親和素更為。現在經過改進的親和素等電點IP可以達到7.0,明顯地消除了原堿性蛋白特征所引起的非特異性吸附。免疫組化sabc法集中體現了目前先進的免疫組化所必必具備的高敏感性、特異性及操作快速、簡便的所有特征。


免疫組化sabc法的特點:
1.穩定性好:鏈酶親和素結合生物素的親和常數是抗原結合抗體反應的百萬倍,二者結合形成復合物的解離常數很小。因此,SABC法在實際應用中,穩定性高,減少了操作誤差,提高了檢測的度
2.特異性高:鏈酶親和素與生物素間的結合具有的親和力,其反應呈高度特異性。因此,SABC法的多級放大作用不僅可以提高檢測的靈敏度,同時還避免了非特異性干擾
3.高敏感性:生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合,形成生物素衍生物結構,該結構具有保持大分子物質的原生物活性功能,同時,每個鏈酶親和素分子有四個生物素結合部位,可以多價形式同時結合生物素化的大分子衍生物和酶標記物。因此,SABC法具有多級放大作用,使其在免疫組化實驗時大大地提高檢測方法的靈敏度。


附免疫組化sabc法操作步驟:
1.切片脫蠟至水
2.新鮮配置3%H2O2,室溫10分鐘,滅活內源性酶,然后用蒸餾水沖洗2分鐘三次
3.微波修復:將切片放入盛有PBS緩沖液(PH7.2-7.6)的杯子中,在微波爐里加熱煮沸,微波爐中靜置5分鐘,拿出室溫冷卻6分鐘,再微波續熱至沸騰后完全室溫冷卻
4.滴加5%BSA封閉液,37℃反應30分鐘。甩去多余液體,不洗
5.滴加一抗,4℃反應24小時左右。所配一抗的濃度為1µg/ml

6.PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次,滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反應30分鐘
7.PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次,滴加試劑SABC,37℃反應30分鐘,PBS洗30分鐘×3次
8. DAB室溫顯色,鏡下控制反應時間,蒸餾水洗滌
9. 滴加蘇木素輕度復染60秒,蒸餾水洗滌后浸入飽和Na2HPO4溶液中2分鐘,取出后洗滌,37℃恒溫箱干燥經過12個小時左右,中性樹膠封片。

 
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